1. Klassifizierung
Die Gelelektrophorese wird in vertikale Typen (einschließlich Säulengele und Plattengele) und horizontale Typen (hauptsächlich Plattengele) unterteilt (Abbildung 6-18). Im Allgemeinen ist die vertikale Trennung etwas besser als die horizontale, aber die horizontale Gelvorbereitung hat mindestens vier Vorteile: Das gesamte Gel wird gestützt, was die Verwendung von Agarose mit niedriger Konzentration ermöglicht; es ist möglich, Agarosegelplatten unterschiedlicher Spezifikationen herzustellen; Gelvorbereitung und Probenbeladung sind bequemer; Die Elektrophoresekammer ist einfach zu konstruieren und kostengünstig. Da bei der horizontalen Elektrophorese die Agarosegelplatte vollständig etwa 1 mm unter der Oberfläche des Elektrophoresepuffers eingetaucht ist, wird sie auch als getauchte Elektrophorese bezeichnet.
Elektrophoresetank DYCP-31DN für die Agarosegelelektrophorese
2.Puffersystem
Bei der Nukleinsäuretrennung verwenden die meisten Systeme kontinuierliche Systeme. Zu den häufig verwendeten Elektrophoresepuffern gehören TBE-Puffer (0,08 mol/L Tris·HCl, pH 8,5, 0,08 Mol/L Borsäure, 0,0024 Mol/L EDTA) und THE (0,04 Mol/L Tris·HCl, pH 7,8, 0,02 Mol/L). Natriumacetat, 0,0018 mol/L EDTA-Puffer. Diese Puffer werden im Allgemeinen als 10-fache Stammlösungen hergestellt und bei Gebrauch auf die erforderliche Konzentration verdünnt. Die Migrationsraten linearer und zirkulärer DNA im Agarosegel variieren je nach verwendetem Puffer. Im THE-Puffer ist die Migrationsrate linearer DNA größer als die zirkulärer DNA, während im TBE-Puffer das Gegenteil der Fall ist.
3. Vorbereitung des Agarosegels
(1) Vorbereitung des horizontalen Agarosegels
(a) Bereiten Sie die erforderliche Konzentration an Agarosegel unter Verwendung von 1x Elektrophoresepuffer vor.
(b) Erhitzen Sie die Agarose bis zur vollständigen Auflösung entweder in einem kochenden Wasserbad, auf einem Magnetrührer oder in der Mikrowelle. Kühlen Sie die Agaroselösung auf 55 °C ab und fügen Sie Ethidiumbromid (EB)-Farbstoff bis zu einer Endkonzentration von 0,5 μg/ml hinzu.
(c) Versiegeln Sie die Kanten von Glas- oder Acrylplatten mit einer kleinen Menge Agarosegel, fügen Sie einen Kamm hinzu und positionieren Sie die Kammzähne etwa 0,5 bis 1,0 mm über der Platte.
(d) Gießen Sie die geschmolzene Agarosegellösung kontinuierlich in die Glas- oder Acrylplattenform (die Dicke hängt vom Volumen der DNA-Probe ab) und vermeiden Sie dabei die Einführung von Luftblasen. Lassen Sie es bei Raumtemperatur auf natürliche Weise erstarren.
(e) Entfernen Sie den Kamm nach vollständiger Verfestigung vorsichtig. Geben Sie eine angemessene Menge Elektrophoresepuffer in den Geltank und achten Sie darauf, dass die Gelplatte etwa 1 mm unter der Oberfläche des Elektrophoresepuffers eingetaucht ist.
(2) Herstellung eines vertikalen Agarosegels
(a) Entfernen Sie Fett oder Rückstände von Glasplatten durch Waschen mit Ethanol.
(b) Platzieren Sie Distanzplatten zwischen den vorderen und hinteren Dämmen, richten Sie die Kanten der Distanzplatten an den vorderen und hinteren Dämmen aus und befestigen Sie sie mit Klammern.
(c) Fügen Sie 2 % Agarose in 1x Puffer zwischen den Rändern der Abstandsplatten hinzu, um einen 1 cm hohen Agarosepfropfen am Boden der Gelgießkammer zu bilden.
(d) Gießen Sie das geschmolzene Agarosegel in der gewünschten Konzentration, zubereitet in 1x Puffer, in die Gelkammer bis zu 1 cm unter der Oberseite.
(e) Setzen Sie den Kamm ein und achten Sie darauf, dass keine Luftblasen unter den Kammzähnen eingeschlossen werden. Manchmal können beim Abkühlen des Agarosegels Falten an den Kammzähnen entstehen; Geben Sie in solchen Fällen einfach etwas geschmolzene Agarose oben hinzu, um es zu verfestigen.
(f) Entfernen Sie den Kamm. Um ein Auslaufen von Puffer im Ladeschlitz zu verhindern, verschließen Sie die Verbindung zwischen der Agarosegelplatte und der Elektrophoresekammer mit 2 % Agarose und geben Sie die erforderliche Menge Puffer hinzu.
(g) 1x Elektrophoresepuffer in die Gelkammer geben.
(h) Laden Sie DNA-Proben vorsichtig auf das Agarosegel unter dem Puffer.
Weitere Informationen zum Grundwissen zur Agarosegelelektrophorese werden wir nächste Woche veröffentlichen. Ich wünsche Ihnen, dass diese Informationen für Ihr Experiment hilfreich sind.
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Zeitpunkt der Veröffentlichung: 07.12.2023