Probenvorbereitung undLaden
Da in den meisten Fällen ein kontinuierliches Puffersystem ohne Stapelgel verwendet wird, sollten die Proben eine angemessene Konzentration und ein kleines Volumen aufweisen. Verwenden Sie aPipetteGeben Sie die Probe langsam hinzu, mit 5–10 μg pro Vertiefung, um eine signifikante Verschlechterung der Auflösung zu vermeiden. WannProbe laden, muss die Stromversorgung ausgeschaltet sein. Die Probe sollte einen Indikatorfarbstoff (0,025 % Bromphenolblau oder -orange) und Saccharose (10–15 %) oder Glycerin (5–10 %) enthalten, um ihre Dichte zu erhöhen, die Probe zu konzentrieren und Diffusion zu verhindern. Allerdings können Saccharose oder Glycerin manchmal U-förmige Banden in den Elektrophoreseergebnissen verursachen, was durch die Verwendung von 2,5 % Ficoll (Polyvinylpyrrolidon) vermieden werden kann.
Elektrophorese
Die Spannung für die Elektrophorese beträgt 5–15 V/cm, im Allgemeinen etwa 10 V/cm. Für die Trennung großer Moleküle sollte die Spannung niedriger sein und in der Regel 5 V/cm nicht überschreiten.
Färbung
Der Fluoreszenzfarbstoff Ethidiumbromid (EB) wird häufig zum Färben verwendet, um DNA-Banden im Agarosegel zu beobachten. EB kann sich zwischen Basenpaaren von DNA-Molekülen einfügen, wodurch EB an die DNA bindet. Die Absorption von 260 nm ultraviolettem Licht durch DNA wird auf EB übertragen, und das gebundene EB emittiert Fluoreszenz bei 590 nm im rot-orangen Bereich des sichtbaren Lichtspektrums. Durch einstündiges Färben des Gels in einer 1 mmol/L MgSO4-Lösung kann die durch ungebundenes EB verursachte Hintergrundfluoreszenz reduziert werden, was den Nachweis kleiner DNA-Mengen erleichtert.
EB-Farbstoff hat mehrere Vorteile: Er ist einfach zu verwenden, bricht keine Nukleinsäuren, weist eine hohe Empfindlichkeit auf und kann sowohl DNA als auch RNA färben. EB kann jederzeit zur Probe hinzugefügt und mithilfe der UV-Absorption verfolgt werden. Nach der Färbung kann EB durch Extraktion mit n-Butanol entfernt werden.
Allerdings ist der EB-Farbstoff ein starkes Mutagen, und bei der Handhabung sollten Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, beispielsweise das Tragen von Polyethylenhandschuhen. Auch Acridinorange ist ein häufig verwendeter Farbstoff, da er zwischen einzelsträngigen und doppelsträngigen Nukleinsäuren (DNA, RNA) unterscheiden kann. Es zeigt grüne Fluoreszenz (530 nm) für doppelsträngige Nukleinsäuren und rote Fluoreszenz (640 nm) für einzelsträngige Nukleinsäuren. Darüber hinaus können zum Färben auch andere Farbstoffe wie Methylenblau, Methylengrün und Chinolin B verwendet werden.
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Zeitpunkt der Veröffentlichung: 20. Dezember 2023