Vorbereiten eines Agarosegels für die Elektrophorese

Vorbereitung von Agarosegel für die Elektrophorese

Hinweis: Tragen Sie immer Einmalhandschuhe!

Schritt-für-Schritt-Anleitung

Wiegen von Agarose-Pulver:uVerwenden Sie Wägepapier und eine elektronische Waage, um 0,3 g Agarosepulver abzumessen (basierend auf einem 30-ml-System).

Vorbereiten des TBST-Puffers:pBereiten Sie 30 ml 1x TBST-Puffer in einem 100-ml-Erlenmeyerkolben vor.

Agarose-Pulver auflösen:pGeben Sie das Agarosepulver in den TBST-Puffer und schütteln Sie es gut.Setzen Sie sie einin die Mikrowelle geben und erhitzen (normalerweise 50 Sekunden lang, mit Aluminiumfolie abgedeckt), bis es vollständig aufgelöst ist.

Abkühlen und Hinzufügen von Nuklease:uNehmen Sie die Mischung mit Handschuhen aus der Mikrowelle und lassen Sie sie in kaltem Wasser leicht abkühlen, bis sie warm ist (ca. 60 °C). Fügen Sie 2 µl Nuklease (Eb-Ersatz) hinzu und schütteln Sie es gründlich, um es gründlich zu vermischen.

Vorbereiten der Gelform:

• CMageren und trocknen Sie dieGelschale und Gelgießgerätdes Elektrophoresetanks.
•  PSchnüren Sie das GelTablettin den Innentank und setzen Sie den Kamm an einer festen Position ein.
• Mischen Sie die auf etwa 65 °C abgekühlte Agarosegellösung und gießen Sie sie vorsichtig auf dieGeltablettimGelgießgerätVerteilen Sie es langsam, bis eine gleichmäßige Gelschicht auf der Glasplatte entsteht.
• Lassen Sie es bei Raumtemperatur stehen, bis das Gel vollständig erstarrt ist.
• Ziehen Sie den Kamm vorsichtig senkrecht ab und entfernen Sie das Klebeband.
• Platzieren Sie das GelTablettin den Elektrophoresetank.

Wichtig: Stellen Sie sicher, dass sich im Bereich der Kammzähne keine Luftblasen befinden. Die Oberfläche der Flüssigkeit sollte glatt und ohne Wellen sein.

Das Gel laufen lassen

Laden des Gels

Nachdem sich das Gel verfestigt hat, geben Sie es in den Elektrophoresetank und gießen Sie den Elektrophoresepuffer ein, bis das Gel eingetaucht ist.

Proben vorbereiten

• Nehmen Sie den Marker und den Ladepuffer aus dem Kühlschrank.
• 6 µl Ladepuffer zu den Proben hinzufügen und gut mischen.
• Laden Sie die Proben mit einer Mikropipette langsam in die großen Vertiefungen des Gels (achten Sie darauf, das Gel nicht zu durchstechen und nicht das gesamte Volumen abzugeben, um Luftblasen zu vermeiden).
• Laden Sie den Marker in eine der kleinen Vertiefungen (merken Sie sich seine Position).

Elektrophorese starten

• Decken Sie den Elektrophoresetank ab und starten Sie die Elektrophorese sofort nach dem Laden des Gels.
• Stellen Sie die Spannung auf 60-100 V ein. Die Proben wandern von der negativen Elektrode (schwarz) zur positiven Elektrode (rot).
• Eine höhere Spannung verkürzt den effektiven Trennbereich des Agarosegels.
• Stoppen Sie die Elektrophorese, wenn der Bromphenolblau-Farbstoff etwa 1 cm von der Unterkante der Gelplatte entfernt ist.

Ergebnisse beobachten

Stoppen Sie nach dem Trennen der Banden die Elektrophorese, nehmen Sie das Gel heraus und erfassen und fotografieren Sie es direkt.

Verwenden Sie ein Gel-Bildgebungssystem, um die Banden zu fotografieren und zu beobachten (überprüfen Sie, ob Banden für den Marker oder die Proben vorhanden sind).

Nachdem Sie Ihre Gelbandkarte erhalten haben, suchen Sie die Markierung. Anhand der Markierung können Sie die Zielbänder bestimmen!

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