Wir haben letzte Woche mehrere Überlegungen zur Verwendung der Zelluloseacetat-Membranelektrophorese geteilt und werden dieses Thema heute hier als Referenz beenden.
Auswahl von Pufferkonzentration
Die bei der Zelluloseacetat-Membranelektrophorese verwendete Pufferkonzentration ist im Allgemeinen niedriger als die bei der Papierelektrophorese. Der üblicherweise verwendete pH-Wert beträgt 8,6BArbitalpuffer wird typischerweise im Bereich von 0,05 mol/L bis 0,09 mol/L gewählt. Bei der Auswahl der Konzentration erfolgt eine vorläufige Festlegung. Wenn beispielsweise die Länge des Membranstreifens zwischen den Elektroden in der Elektrophoresekammer 8–10 cm beträgt, ist eine Spannung von 25 V pro Zentimeter Membranlänge erforderlich, und die Stromstärke sollte 0,4–0,5 mA pro Zentimeter Membranbreite betragen. Werden diese Werte bei der Elektrophorese nicht erreicht oder überschritten, sollte die Pufferkonzentration erhöht oder verdünnt werden.
Eine zu niedrige Pufferkonzentration führt zu einer schnellen Bewegung der Bänder und einer Vergrößerung der Bandbreite. Andererseits verlangsamt eine zu hohe Pufferkonzentration die Bandenwanderung, wodurch es schwierig wird, bestimmte Trennbanden zu unterscheiden.
Es ist zu beachten, dass bei der Zelluloseacetat-Membranelektrophorese ein erheblicher Teil des Stroms durch die Probe geleitet wird, wodurch eine erhebliche Wärmemenge entsteht. Manchmal kann die gewählte Pufferkonzentration als angemessen angesehen werden. Unter Bedingungen erhöhter Umgebungstemperatur oder bei Verwendung höherer Spannung kann es jedoch zu einer verstärkten Verdunstung von Wasser durch die Hitze kommen, was zu einer zu hohen Pufferkonzentration und sogar zum Austrocknen der Membran führen kann.
Probenvolumen
Bei der Zelluloseacetat-Membranelektrophorese wird das Probenvolumen durch verschiedene Faktoren bestimmt, darunter Elektrophoresebedingungen, Eigenschaften der Probe selbst, Färbemethoden und Nachweistechniken. Generell gilt: Je empfindlicher die Nachweismethode, desto kleiner kann das Probenvolumen sein, was für die Trennung von Vorteil ist. Wenn das Probenvolumen zu groß ist, sind die elektrophoretischen Trennmuster möglicherweise nicht klar und die Färbung kann auch zeitaufwändig sein. Bei der quantitativen Analyse der getrennten gefärbten Banden mithilfe elutionskolorimetrischer Nachweismethoden sollte das Probenvolumen jedoch nicht zu klein sein, da dies zu niedrigeren Absorptionswerten für bestimmte Komponenten und damit zu höheren Fehlern bei der Berechnung ihres Gehalts führen kann. In solchen Fällen sollte das Probenvolumen entsprechend erhöht werden.
Typischerweise liegt das Probenvolumen, das pro Zentimeter der Probenaufgabelinie hinzugefügt wird, zwischen 0,1 und 5 μL, was einer Probenmenge von 5 bis 1000 μg entspricht. Beispielsweise überschreitet bei der routinemäßigen Serumproteinelektrophoreseanalyse das auf jedem Zentimeter der Auftragslinie hinzugefügte Probenvolumen im Allgemeinen nicht 1 μL, was 60 bis 80 μg Protein entspricht. Bei der Analyse von Lipoproteinen oder Glykoproteinen mit der gleichen Elektrophoresemethode muss jedoch das Probenvolumen entsprechend erhöht werden.
Abschließend sollte das am besten geeignete Probenvolumen anhand spezifischer Bedingungen durch eine Reihe von Vorversuchen ausgewählt werden.
Auswahl der Färbelösung
Die getrennten Banden bei der Zelluloseacetat-Membranelektrophorese werden typischerweise vor dem Nachweis angefärbt. Unterschiedliche Probenkomponenten erfordern unterschiedliche Färbemethoden, und die für die Celluloseacetat-Membranelektrophorese geeigneten Färbemethoden sind möglicherweise nicht vollständig auf Filterpapier anwendbar.
Bei der Auswahl einer Färbelösung gibt es drei HauptprinzipienZelluloseacetatmembran. Erstens,Wasserlösliche Farbstoffe sollten gegenüber alkohollöslichen Farbstoffen bevorzugt werden, um eine Schrumpfung und Verformung der Membran durch deren Färbelösung zu vermeiden. Nach dem Färben ist es wichtig, die Membran mit Wasser abzuspülen, um die Färbedauer zu minimieren. Andernfalls kann es zu einer Wellung oder Schrumpfung der Membran kommen, was die spätere Erkennung beeinträchtigen würde.
Zweitens ist es vorzuziehen, Farbstoffe mit starker Färbeaffinität für die Probe auszuwählen. Bei der Celluloseacetat-Membranelektrophorese von Serumproteinen wird Aminoschwarz 10B aufgrund seiner starken Färbeaffinität für verschiedene Serumproteinkomponenten und seiner Stabilität häufig verwendet.
Drittens sollten zuverlässige Qualitätsfarbstoffe gewählt werden. Einige Farbstoffe können trotz gleichnamiger Bezeichnung Verunreinigungen enthalten, die nach dem Färben zu einem besonders dunklen Hintergrund führen. Dies kann sogar dazu führen, dass die ursprünglich gut getrennten Bänder verschwimmen und somit schwer zu unterscheiden sind.
Schließlich ist die Wahl der Konzentration der Färbelösung wichtig. Theoretisch könnte es scheinen, dass eine höhere Konzentration der Färbelösung zu einer gründlicheren Färbung der Probenbestandteile und besseren Färbeergebnissen führen würde. Dies ist jedoch nicht der Fall. Die Bindungsaffinität zwischen den Probenbestandteilen und dem Farbstoff hat eine bestimmte Grenze, die mit zunehmender Konzentration der Färbelösung nicht ansteigt. Im Gegenteil: Eine zu hohe Konzentration der Färbelösung verschwendet nicht nur den Farbstoff, sondern erschwert auch die Erzielung eines klaren Hintergrunds. Darüber hinaus folgt die Absorptionskurve des Farbstoffs, insbesondere bei quantitativen Messungen, keinem linearen Zusammenhang, wenn die Farbintensität einen bestimmten Maximalwert erreicht. Bei der Celluloseacetat-Membranelektrophorese ist die Konzentration der Färbelösung im Allgemeinen niedriger als bei der Papierelektrophorese.
Wissenswertes über Beijing Liuyi Biotechnology's ZelluloseacetatmembranElektrophoresetank und seine Elektrophoreseanwendung finden Sie hier:
lExperiment zur Trennung von Serumprotein durch Celluloseacetatmembran
lZelluloseacetat-Membranelektrophorese
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Referenz:Elektrophorese (Zweite Auflage) von Herrn Li
Zeitpunkt der Veröffentlichung: 06.06.2023